α-Gal抗原定量檢測(cè)試劑盒（標(biāo)準(zhǔn)方法）說(shuō)明書(shū) 使用目的：本試劑盒適用于動(dòng)物源性醫(yī)療器械、動(dòng)物組織及其衍生物等相關(guān)樣本中α半乳糖基抗原（α-Gal）含量的定量檢測(cè)。
試劑盒原理：本試劑盒完全按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 動(dòng)物源性支架材料殘留α-Gal抗原檢測(cè)》中給出的方法，利用特異性抗-Gal抗體的酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法（競(jìng)爭(zhēng)性ELISA或者ELISA抑制法）。即：在保證抗原抗體反應(yīng)物中特異性抗體過(guò)量的前提下，首先標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品及試驗(yàn)樣品的α-Gal抗原與特異性抗體反應(yīng)（消耗部分抗體）；然后用人工合成的Gal抗原（Gal-BSA）作為固相抗原，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)第一次反應(yīng)后上清液中的剩余抗體；進(jìn)而可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)物中的α-Gal抗原含量。
試劑盒組成:試劑盒A (2~8℃保存
)
| 1 |
Gal抗原包被板 |
8孔×12條 |
| 2 |
裂解液 |
50 ml×1瓶 |
| 3 |
抗體Ⅰ稀釋液 |
12ml×1瓶 |
| 4 |
酶標(biāo)試劑 |
12 ml×1瓶 |
| 5 |
濃縮洗滌液 |
50 ml×1瓶 |
| 6 |
顯色液A液 |
8 ml×1瓶 |
| 7 |
顯色液B液 |
8 ml×1瓶 |
| 8 |
終止液 |
8 ml×1瓶 |
| 9 |
覆板貼膜 |
3張 |
| 10 |
說(shuō)明書(shū) |
1份 |
| 11 |
自封袋 |
1個(gè) |
試劑盒B （-20℃保存）
| 1 |
苯甲基磺酰氟（PMSF） |
0.9 ml×1瓶 |
| 2 |
Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品 |
120μl×1瓶 |
| 3 |
抗體Ⅰ(特異性抗-Gal抗體) |
0.6ml×1瓶 |
自備材料：1. Gal抗原陰/陽(yáng)性參考品為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì), 須自行到中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買(mǎi)。
- 2ml或5ml離心管；
- 移液器及吸頭。
樣本要求：樣品采集后，盡早進(jìn)行樣本制備并檢測(cè)，若不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，須在-20℃保存并避免反復(fù)凍融。
安全性：
- 避免接觸試劑盒中的顯色液A液、B液以及終止液，一旦接觸需立即用大量水沖洗；
- 試驗(yàn)過(guò)程中不要吸煙、飲食以及使用化妝品；
- 不要用嘴吸試劑盒中的任何液體。
試劑盒的保存和使用注意事項(xiàng):1. 試劑盒分A和B兩盒，A盒各組分需要在2~8℃保存，B盒各組分需要在-20℃保存，使用前恢復(fù)到室溫并充分混合均勻；
2. 根據(jù)樣品的量決定所需要的板子條數(shù)，建議樣品做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，并密封保存，防止受潮；
3. 未用完的試劑，應(yīng)包裝好，避免不同批號(hào)混用，同時(shí)避免長(zhǎng)期打開(kāi)蓋子放置；
4. 試劑盒過(guò)保質(zhì)期不要使用；
5. 顯色液B液對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)期暴露于陽(yáng)光下，避免用手接觸，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)讀取OD值；
6. 裂解液在使用前需要按照裂解液體積1%的量加入苯甲基磺酰氟（以下簡(jiǎn)稱(chēng)PMSF），現(xiàn)用現(xiàn)加，加入PMSF的裂解液要一次用完，不可存留再用；
7. 抗體Ⅰ需要使用抗體Ⅰ稀釋液進(jìn)行20倍稀釋后使用；
8. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水；
9. 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有孔反應(yīng)時(shí)間一樣；
10. 按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的時(shí)間以及順序進(jìn)行操作。
樣品預(yù)處理:1. Gal抗原陰/陽(yáng)性參考品制備：精確稱(chēng)取一定量的陰性/陽(yáng)性參考品，置于2ml或5ml無(wú)菌離心管內(nèi)，加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），制成樣品濃度為2mg/ml混懸液，在室溫放置3h后，4000r/min、離心10min，取上清液備用。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品制備：在陰性參考品樣品中加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），配制成2mg/ml作為陰性基質(zhì)液，在其中加入Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度為 4μg/ml，之后依次用等量陰性基質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嫌?jì)7個(gè)系列濃度。
3. 檢測(cè)樣品的制備：精確稱(chēng)取試驗(yàn)樣品（2 mg～10 mg）置于2ml或 5 ml無(wú)菌離心管內(nèi)，若為固態(tài)塊狀或片狀試驗(yàn)樣品，則用無(wú)菌眼科剪將樣品剪裁成細(xì)小碎塊。加入裂解液到一定濃度（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），濃度根據(jù)樣品大致含α-Gal抗原量決定，低溫勻漿2 min～10 min，至樣品全部粉碎，無(wú)肉眼可見(jiàn)明顯顆粒，形成均勻組織勻漿。室溫放置3 h至樣品全部裂解，4000r/min離心10min，取上清液備用。
樣品與抗體Ⅰ反應(yīng)：
將制備好的樣品與抗體Ⅰ（使用抗體Ⅰ稀釋液將抗體Ⅰ進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)┑润w積混合（標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為2 μg/ml，1 μg/ml，0.5 μg/ml，0.25 μg/ml，0.125 μg/ml，0.0625 μg/ml，0.03125 μg/ml；檢測(cè)樣品的終濃度減半）后，在37℃輕微震蕩溫育2h，之后轉(zhuǎn)4℃過(guò)夜。使用前在14000×g，4℃，離心30min后，取上清使用。
試劑盒操作過(guò)程（剩余抗體I的檢測(cè)）:1. 配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或純化水20倍稀釋。
2. 加樣：分別在相應(yīng)孔中加入抗體Ⅰ反應(yīng)后的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品上清液各100 μl。
3. 溫育：用封板膜封板后，置37℃震蕩溫育60分鐘。
4. 洗板：小心揭掉封板膜，用排槍或其他移液器吸干樣品，在每孔中注入洗液200 μl，浸泡30 s，棄去板孔中洗液，洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
5. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl。
6. 溫育：用封板膜封板后，置37℃震蕩溫育30分鐘。
7. 洗板：小心揭掉封板膜，用排槍或其他移液器吸干樣品，在每孔中注入洗液200 μl，浸泡30 s，棄去板孔中洗液，洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
8. 顯色：將顯色液A液和顯色液B液等體積混合均勻，每孔加入混合好的顯色液100 μl，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色30分鐘。
9. 測(cè)定：取出酶標(biāo)板，迅速在每孔加終止液50 μl，輕輕振蕩混勻后，立即測(cè)定結(jié)果。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析:1. 根據(jù)測(cè)定的吸光度值，計(jì)算各樣品的抗體I結(jié)合抑制率。
IR = ｛(M-b)-(T-b)｝/(M-b)×100 %
式中:
IR --抗體I結(jié)合抑制率(Inhibition rate),%；
M --抗體I/陰性基質(zhì)液反應(yīng)OD值均值（100 %反應(yīng)）；
T --試驗(yàn)樣品反應(yīng)(Test sample)OD值均值（剩余抗體I的反應(yīng)）；
b --裂解液反應(yīng)(blank)OD值均值。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品樣品系列稀釋濃度為橫坐標(biāo)（X），抗體I結(jié)合抑制率（小數(shù)）為縱坐標(biāo)繪制最佳曲線(xiàn)方程，推薦使用對(duì)數(shù)方程，或者四參數(shù)方程軟件，獲得四參數(shù)方程，直接把待測(cè)樣品的抗體I結(jié)合抑制率代入方程式，計(jì)算待測(cè)樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品（Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品）的量，再乘以1.82×10
14/μg(Gal-BSA)，計(jì)算單位質(zhì)量待測(cè)樣品的Gal抗原含量。
試劑盒性能：1. 靈敏度：最小的檢測(cè)濃度≥標(biāo)準(zhǔn)品的第5個(gè)倍比系列稀釋濃度。樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為＞0.950。
2. 特異性：Gal抗原陰性生物材料參考品不會(huì)檢出Gal抗原，陰性參考品的檢測(cè)OD值與裂解液對(duì)照孔的反應(yīng)OD值不存在顯著性差異。
3. 重復(fù)性：樣品檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)（CV）≤30%。
4. 檢測(cè)回收率：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品的檢測(cè)回收率為80%～120%。
試劑盒局限性：樣品前處理是影響最終檢測(cè)結(jié)果的重要因素，應(yīng)保證抗原的充分暴露。樣品中基質(zhì)的干擾不可避免，為非線(xiàn)性的。因此，需要盡可能保證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品的組成與待檢測(cè)樣品的組成相同或者相近。
試劑盒有效期:試劑盒有效期為一年。
